TP2776表征两个不同工作范围的双感测系统电感式生物传感器

1.前言

业界对高敏感度、高特异性、低成本、易携带的生物传感器的研发兴趣有增无减。这些要求对于医疗、食品、制药、临床等应用领域具有重要意义。高敏感度和高特异性是生物传感器的核心要素，通过整合适合的变送方法与适合的生物过程，例如，免疫分析法和/或核酸杂交，可以实现高敏感度和高特异性。生物传感器概念的核心是把特定生物识别事件转换成电信号并输出。生物识别事件是通过一个涉及使用适合的标记法的生物过程，来识别分析物（抗原或DNA序列）与其特定识别元件（抗体或寡核苷酸)之间发生的特定生物事件。标记物可以是磁性、放射性、酶、荧光、电化或电介质物质。应根据特定应用的功能选择适合的标记物。

在这种情况下，使用磁性颗粒作为免疫分析法的标记物(夹心式免疫分析法和竞争性免疫分析法均使用这种方法)有潜在优势，这与其极高的稳定性、低成本、无毒、易感测有关。

通过选用适合的标记法，可直接量化磁珠数量，无需再为获取可测量的信号而执行其它操作。现有多种不同的磁珠感测方法，例如，磁阻传感器、微机械悬臂装置 、超导量子干涉仪、自旋阀、霍尔探针、磁通门磁力计。另一种感测方法是把样品置于线圈内或附近，线圈同时还兼作致动器和传感器。微射流系统是线圈被用作致动器的例子:在微射流系统的通道中，电感器用于分离磁性颗粒上固定化的生物分子。

一个新方法是使用磁珠进行量化，利用磁珠磁芯来影响初级线圈磁场的空间分布，这样，可以使用一个次级线圈感测与磁性颗粒链接的生物分子。事实上，样品中磁性颗粒的存在可改变次级线圈电感。使用线圈充当感测结构有一个重要的优点，即关系到能否实现集成结构。与宏观电磁阀相比，采用硅技术集成电感元件有很多潜在优点，其中包括与制造成本、产品良率和平面电感器件可再制性相关的优点。此外，产品尺寸最小化可以大幅降低被分析物质的取样量，降低每个分析实验的试剂成本。高集成度还为开发更复杂的感测系统带来一个有趣的观点，例如，可同时感测多个物种的传感器阵列。

这种磁性生物传感器的感测敏感度完全取决于感受器（抗体）与目标分子（抗原）的亲和性、线圈参数、感测电路的稳定性，最重要地是，磁性颗粒的特征。

如前文所述，因为与感受器链接的磁性颗粒的存在,电感方法可通过测量线圈电感的变化来识别目标分子。

可用多种方法测量电感变化。在参考文献中，作者提论述了如何利用相关设计、有限元素法仿真和采用硅技术制造集成电感元件来提高传感器的敏感度。该方法是用一个阻抗分析仪测量电感。为提高传感器对磁性颗粒存在的敏感度，在线圈区域的衬底背面局部沉积一个磁层。

本文讨论一个新的电感生物传感器。这项成果是参考文献的传感器在参考文献的仿真结果基础上进化的结果。准确地讲，该传感器架构经过优化设计，主要考虑次级线圈相对于初级线圈中心的位置、线宽和线的间隔。此外，我们还开发一个新的信号调理产品，使传感器响应性能高于参考文献描述的传感器，因为存在两个感测系统，可完全表征两个不同的工作区，本文以下章节给予详细介绍。

本文主要内容如下：下一章即第二章介绍传感器工作原理以及布局设计和制造技术；一套验证磁特性的实验方法。第三章先是简要介绍信号调理电子元件和所用磁珠，然后介绍并探讨集成双感测系统的生物传感器的全面表征功能。

2.电感式生物传感器

2.1.        工作原理

该生物传感器由一个初级线圈和两对次级线圈组成，构成两个不同的感测系统，如图1所示。在每个感测系统内，两个次级线圈的绕线方向相反，以差分方式相连。在每对次级线圈中，只有一个线圈对磁性颗粒敏感；另一个线圈可去除变压器总输出中的寄生效应。初级线圈由交流信号驱动，产生一个与所有次级线圈相关的磁场。


图1.生物传感器结构示意图：黑色部分是初级线圈；绿色部分是大感测系统；红色部分是小感测系统。

在每个感测系统中，因为感测线圈绕线方向相反,初级线圈产生的磁场在次级线圈上感应出的两个电压大小相等但极性相反; 因此，当不存在磁性颗粒时，两个输出信号的电压差值为零。 如前文所述，在每个感测系统内，磁性颗粒只置于其中一个线圈（工作线圈）上;另一个线圈充当“替身”，用于去除常见干扰输入。当磁性颗粒置于工作线圈上时，磁通量线将会重新分布，并产生一个非零的输出电压。

2.2.        传感器设计和制造工艺

很多化学反应需要考虑温度，因为大多数化学反应规则需要特定温度或温度循环。为开发一个适合多种应用的生物传感器，需要在传感器芯片版图上整合热致动结构(在一个区域内确定统一的温度或恒定的梯度)和热控制结构(精确控制温度)。根据参考文献介绍的制造工艺，我们采用硅技术制造生物传感器。更详细地讲，第一个金属层用于制造加热器和热阻，两个热结构都经过测试。用一个6V直流信号驱动加热器，温度可达100°C以上；温度传感器可精确测量加热器温度。第二个金属层用于制造初级线圈；第三个金属层用于制造两个感测系统(次级大线圈和次级小线圈)。图2所示是两个不同的传感器芯片版图，一个有热结构，另一个没有热结构。根据参考文献描述的程序，我们对温度感测和热致动进行了实验表征。本文讨论无热结构生物传感器的表征。

         
a)       


b)
图2：两个不同的生物传感器芯片版图; 图a：传感器(红色和蓝色)和热结构(青色); 图b，无热结构传感器

电感值主要与线圈材质和设计有关；同样地，磁场也与线圈设计有关。既然传感器行为与几何学参数紧密相关，为找到尽可能最好的配置，我们设计并制造了八个不同的传感器版图。这些芯片版图拥有相同的线圈匝数、线宽和间隔。这八个传感器分别叫做1B、2B、…8B。按照参考文献列出的仿真结果，我们为所有传感器（8B除外）选定了线宽和间隔，以及次级大小线圈的位置。表1列出每个传感器的几何参数。为避免环境噪声，设计一个外部接地保护环路。

表1传感器的几何参数


图3所示是传感器5B。
  

图3：在光学显微镜下的传感器5B

2.3.        磁耦合

为确定最好的工作频率，我们采用了图4的磁耦合检测配置：用幅值恒定变频正弦信号驱动初级线圈，在1MHz-20MHz范围内调节信号频率，同时记录次级大线圈的输出信号。


图4：初级线圈和次级线圈磁耦合效应电子测试方法

图5是测试结果。不难发现，次级大线圈的信号幅值与谐振频率大约15MHz的频率是函数关系。传感器表征选用这个频率。


图5：传感器输出与频率呈函数关系的行为特性。用图4的电子测量方法获取信号

因为磁耦合与设计参数呈函数关系，例如，初级线圈匝数和次级线圈匝数，为表征磁耦合，我们做了一系列测量实验。
几何参数与电参数的关系见方程式1。

        (1)

其中，N1和N2 表示初级线圈和次级线圈的匝数；R1和R2分别是初级线圈和次级线圈的电阻；i1 是初级线圈的电流；L’2 是次级工作线圈的电感，而ΔL 是磁性物质出现导致工作线圈的电感变化。

次级大小线圈的磁耦合效应经过检查。图6给出了次级大线圈的测量结果。根据方程式(1)，输出信号幅值随一次级线圈匝数增加而升高。更详细地讲，如果次级线圈匝数固定(图中的Ns)，输出信号幅度随初级线圈匝数增加而升高，反之亦然。两个次级线圈理论上完全相同，但是还是有细微差别存在。因此，从不存在磁性物质的零开始，输出电压就出现不同的数值，不过，电压值大约只有几毫伏。这个问题放在下一章讨论，共用同一拓扑的传感器的失调电压值都是恒定值(例如，所有的1B传感器的失调电压都相同)。这个问题容易解决，例如，将两个拓扑相同的传感器紧靠在一起，并计算输信号电压的差值。在这种情况下，显然只有一个传感器是工作传感器。


图6：用恒幅恒频的正弦信号驱动初级线圈时的次级大线圈的输出电压。

次级小线圈是5匝。图7描述了表1列出的每个传感器的输出电压与初级线圈匝数的函数关系特性。同样，次级大线圈输出信号电压随初级线圈匝数增加而升高。


图7： 次级小线圈输出电压与初级线圈匝数保持函数关系

3.电感式生物传感器

3.1.        信号调理电子元件

为表征电感式生物传感器，我们开发出一个适合的信号调理电子元件。为使电流值恒定，避免线圈电阻或电感变化引起峰流，我们采用振幅5Vpp、频率15MHz的正弦信号，通过电压-电流转换器驱动初级线圈。在退耦后，次级线圈信号经非反相放大器放大，提供信号修整所需的振幅。为保证极性绝对为正，放大信号通过钳位电路升压，然后被修正；使用钳位电路可取得更高的响应性能。最后，用一个差分放大器对两个被修整的信号进行放大和去除处理。图8所示是上面讨论的电子元件的机制


图8 用于表征传感器的信号调理电子元件

3.2.        磁珠

如前文所述，本文所讨论的电子元件是用于采用磁性标记物对目标分子存在进行量化的生物传感器。为表征生物传感器的性能，需要在生物传感器的工作线圈上放置不同数量的磁性颗粒，输出电压测量值与磁性物质的质量是函数关系。采用ScreenMAG-Aminemagnetic particles (1 μm of radius) fromChemicell®荧光标记磁珠分离试剂。用水性印刷缓冲液(含有150 mM Na2HPO4, 0.001%的pH值为9.2的甘油)稀释悬浮液，因此，每滴斑液含有4.16ng磁珠。该浓度用于表征次级大线圈(在工作线圈上感测若干个液滴)，还可用于对次级小线圈进行初步表征，以检查小线圈是否能够感测单个液滴。基于用次级小线圈进行初步表征取得的积极结果，我们选择在传感器7B上放置使用较稀的磁性溶液取得的0.416ng-4.16ng不同质量的磁珠，在温湿度可控的1000级无尘室内，用一台有压电尖(节流尺寸40 um)的Perkin Elmer检测仪完成印刷过程。

图9 所示是覆盖在传感器8B上的磁性颗粒。  


图9：传感器8B次级工作大线圈上有12.5ng磁珠。

3.3.        生物传感器表征

两个感测系统(次级大小线圈) 均使用磁珠来表征感测性能。在次级大线圈上，放置五种质量的磁珠，并记录相应的输出电压。
如前文所述，传感器7B的次级小线圈初步表征是使用一滴第一种溶液(4.16 ng)。此外，在工作线圈上放置第二种稀释溶液，以确定传感器对浓度低于4.16 ng的磁珠是否反应。既然次级小线圈感测系统能够测量低质量磁珠，该传感器可用于两种配置：检查特定目标分子是否存在，并通过小线圈信号量化质量更小的目标分子，因为次级大线圈无法测量小质量目标分子。传感器能够耐受两个不同的工作磁场。本文提出的传感器设计共有两个感测系统，因而产生两个不同的工作磁场，但是，根据实际应用情况可能只选用其中一个感测系统。  

图10列出了在传感器1B次级大线圈上重复测量的结果。结果显示良好的再现性。图10b所示是同一传感器的时间稳定性测量结果。测量值集合1和测量值集合2的时间相隔大约1个月。

         
a)       


b)
图10a)在传感器1B次级大线圈上进行的传感器重复性测试；b)在传感器1B次级小线圈上进行的传感器时间稳定性测试；

如前文所述，在八种生物传感器的表征实验中，次级大小线圈均被测试。即使八种传感器的响应性、分辨率、不确定性等参数都被测量，因为数据合成的原因，这里只能提供部分实验性表征。图11列出了在次级大线圈上取得的实验数据以及误差柱状图(@ 3sigma)，不难看出，输出信号电压随着磁珠质量增加而升高。本图只描述了2B和3B两个传感器的行为特性。
         

a)       

b)
图11使用次级大线圈充当感测系统进行的a)2B传感器表征和b)3B传感器表征实验。

若磁珠质量小(低于12ng)，则输出信号幅值小，见图12。图12是图11的感测低质量磁珠时传感器响应性的放大图。在磁珠质量小于12ng时，次级大线圈感测系统的响应性远低于12ng以上时的响应速度，因此，12ng是一个感测门限值。


a)       

b)
图12：磁珠质量低于12.5ng时的输出行为特性的放大图。a)传感器2B的放大图；b)传感器3B的放大图

因此，在12.5ng以下工作范围，感测系统必须使用次级小线圈；次级大线圈用于磁珠质量大于12.5ng的情况。然后，计算出次级大线圈感测系统的模型，不包括磁珠质量小于12.5的情况。图13所示是2B和3B传感器的线性模型以及不确定性范围；图中还有模型方程式。


a)       

b)
图13 a)传感器2B的模型；b)传感器3B的模型，都附有模型方程。

表2列出了八种传感器使用次级大线圈充当感测系统时的响应性、分辨率和不确定性的数值。

表2使用次级大线圈充当感测系统时的响应性和分辨率


除6B传感器没有次级小线圈外，其余的传感器都有次级大线圈和小线圈。为表征次级小线圈感测系统，开始只能放置一滴磁珠溶液，因为一滴就能覆盖整个工作区。图15描述了传感器的部分行为特性（实验数据以及误差柱状图(@ 3sigma)。
         

a)       

b)
图14 通过小线圈感测系统进行的传感器表征；a)2B传感器; b)7B传感器。

图14表明，次级小线圈能够发现并测量质量太小而次级大线圈无法测量的磁珠。另一方面，次级小线圈工作面小，少量的磁珠就能占满全部工作区，使其趋于饱和，故不能测量大质量磁珠。为表征次级小线圈与磁珠质量保持函数关系的行为特性，如前文所述，实验采用了多种不同质量的稀溶液，只有传感器7B采用了四种质量的磁珠，其行为特性见图15。


图15：传感器7B次级小线圈的行为特性与磁珠溶液的质量成函数关系

图16是传感器7B的模型，考虑到了磁珠溶液质量取多个不同值的情况，即考虑到了图15上的点。从图中不难看出，该模型与只考虑一个磁珠质量(即考虑图15b的行为特性)时构建的模型非常相似。
         

a)       

b)
图16a) 考虑到图15中的行为特性取得的传感器7B的模型；b)考虑到图14b的两个点(0和1.16ng)创建的模型(黑色)与 图16a的模型（蓝色）比较。

表3列出了八种传感器使用次级小线圈充当感测系统时的响应性和分辨率数值。

表3：使用次级小线圈充当感测系统时的响应性和分辨率


通过比较表2和表3所列数值，可以确定，当磁珠质量小时，必须使用次级小线圈，因为它具有高响应性和高分辨率。另一方面，当磁珠质量大时，次级大线圈是最佳的感测解决方案。

4.16ng(即次级小线圈的最大检测值)和12.5ng(即次级大线圈的最小检测值)之间是中间带。在这个范围内，如果使用次级小线圈，传感器线性不好；如果使用次级大线圈感测，传感器响应性不好，考虑到这两点，不妨将两个感测系统同时使用。

图17所示是该行为特性。
       

a)       

b)
图17 a)描述了传感器7B与工作范围呈函数关系的行为特性；b) 图17的放大图，突出显示中间带。

4.        结论

本文介绍了一个电感式生物传感器。该传感器能够将特定生物识别事件转换成电信号并输出，这里的生物识别事件是通过一个涉及使用磁性标记物的过程，来识别分析物（抗原或DNA序列）与其特定识别元件（抗体或寡核苷酸)之间发生的特定生物事件。因为热致动和感测的存在，传感器可用于多种生物识别应用，例如，DNA杂交、蛋白质测量等。设计优化和两个不同的感测子系统（小线圈和大线圈）使该传感器取得广泛的动态范围，强化了生物应用功能。下一步工作是提高传感器的响应性，在线圈区的衬底背后沉积磁层，以此提高传感器的敏感度。

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